I mere end 20 år stod marinbiolog Mary Hagedorn overfor et tilsyneladende ufravigeligt problem. Hun ledte efter en måde at fryse og afrime embryoner af zebrafisk.
Et vigtigt forsøgsdyr, zebrafiskgener, tilnærmer sig mennesker tæt tæt på, at de er blevet brugt til at undersøge sygdomme som muskeldystrofi og melanom. Hvis reproduktionsmaterialet let kunne fryses og afrimes, ville disse undersøgelser være lettere at udføre og replikere, da forskere ikke behøver at arbejde omkring gydeskemaer eller kæmpe mod genetisk drift.
Problemet kommer ned på den måde fisk formerer sig på. Forskere har med succes fryset - eller kryopræserveret for at bruge det tekniske udtryk - og afrimet levedygtige sæd og æg fra mange dyr i årtier. Men fiskeæg udvikler sig uden for forældrenes krop, hvilket giver fysiologiske udfordringer, der ikke dukker op, når du arbejder med celler fra kvæg eller endda mennesker. Ægget indeholder de næringsstoffer, som det udviklende embryo har brug for, og har også sin egen rustning, hvilket betyder, at disse æg er store og ofte indkapslet i en relativt uigennemtrængelig membran.
Kort sagt har fiskægene en tendens til at være for store til hurtigt at fryse eller afrime under almindelige omstændigheder. Hagedorn - der arbejder som forskningsbiolog ved Smithsonian's National Zoo and Conservation Biology Institute's Center for Species Survival - sammenligner dem med planeter. Pattedyrsæg er typisk mere som de tyndere medlemmer af vores solsystem - siger, Merkur. Et zebrafiskæg er tættere på en kæmpe som Jupiter.
”Hvis du ikke fryser væv ordentligt, dannes der iskrystaller i det, og de vil gennembore cellerne og ødelægge dem, ” siger Hagedorn.
Hun tilbragte 12 år på at søge efter en løsning, hvor hun til sidst besluttede sig på en ny opløsning, der involverede mikroinjektion af et “krybbeskyttelsesmiddel” (en frostvæske, grundlæggende) i æggene, en teknik, der gjorde det muligt for agenten at omgå den beskyttende membran. Korrekt kalibreret for at undgå forgiftning af cellerne kunne disse beskyttelsesmidler hjælpe med at sikre, at et æg ville jævne blødere (blive glaslignende), når det blev dyppet ned i et flydende nitrogenbad.
”Hvis du ikke fryser væv ordentligt, vil der dannes iskrystaller i det, og de vil gennembore cellerne og ødelægge dem, ” siger Mary Hagedorn om det problem, hun stod overfor ved at fryse zebrafiskembryoer. (Encyclopedia of Life / Bioimages) Mens denne proces effektivt kunne sætte fiskembryoer i en tilstand af suspenderet animation, forblev opvarmning af dem igen igen et problem. Når de varmes, er der et mellemliggende punkt mellem den ideelle glasagtige tilstand og stuetemperatur, hvor iskrystaller kan begynde at dannes igen. Og disse krystaller kan beskadige det cellulære materiale og efterlade det ude af stand til yderligere udvikling.
”Vi var nødt til at optø dem meget hurtigere, ” sagde Hagedorn. ”Brug af de værktøjer, vi havde i 2011. . . Jeg ramte en væg. ”
I et stykke tid gav hun op.
Og det var sådan, tingene kunne have været tilbage, hvis det ikke var for et tilfældigt møde på en kryopbevaringsmøde en gang i 2013, hvor hun hørte en præsentation af John Bischof, en maskiningeniørprofessor ved University of Minnesota.
Som Bischof fortæller det, havde han præsenteret for et ikke-beslægtet emne, der involverede jernoxid-nanopartikler, som hans laboratorium har brugt til sikker genopvarmning af humant væv til transplantation. Hans forskning klikkede med Hagedorn, hvilket fik hende til at tænke over dets potentiale for ikke-pattedyrs applikationer.
”Hun sagde: Hvad kan du gøre for at hjælpe mig med embryonerne, ” husker Bischof.
Det oprindelige spørgsmål fødte et komplekst, igangværende tværfagligt samarbejde - hvori både Hagedorn og Bischof insisterer på vigtigheden af den andres arbejde.
Deres resultater, der blev offentliggjort denne uge i tidsskriftet ACS Nano, tyder på, at det trods alt muligvis er muligt at genopvarme frosne fiskembryoner.
Inspirationen til deres arbejde kom fra indsatsen fra en nu-afdød videnskabsmand ved navn Peter Mazur, som troede, det kunne være muligt at genopvarme frosne embryoner med lasere. (Ja, lasere.) Mens ideen potentielt var sund, er det udfordrende, fortalte Hagedorn mig, at få lasere til at overføre varme til biologisk materiale. Sammen med en anden forsker ved navn Fritz Kleinhans, regnede Mazur imidlertid ud, at det muligvis var muligt at introducere et andet stof i løsningen med embryoet, et der ville hente varme fra laseren og overføre det til det biologiske stof.
I Mazurs tilfælde betød det kønrøg i form af indisk blæk, et stof, der absorberer og formidler varme godt - og et, som Kleinhans siger, du bare kan købe på Amazon.com. Hvis det for eksempel blev placeret omkring et frossent musembryo, kunne en enkelt laserpuls næsten øjeblikkeligt bringe det cellulære materiale til stuetemperatur ved at omgå den mellemliggende fase af opvarmning, hvor iskrystaller truer med at dannes. Kleinhans siger, at hun i den tidligere fase af Hagedorns arbejde havde håbet, at teknikken også kunne fungere for zebrafiskembryoer. Desværre var de stadig for store, og på det tidspunkt, hvor den udvendige varme kom til centrum, var der allerede dødelige iskrystaller.
Da Hagedorn, Bischof og deres samarbejdspartnere skriver i deres nye papir, var der imidlertid en anden måde. At sprede Indien-blæk på ydersiden af embryoet har måske ikke været nok, men hvad nu hvis de indsatte noget andet responsivt materiale inden de fryser? For at gøre det, bosatte de sig på guld nanoroder - minuscule molekylstrukturer, størrelsesordener mindre end et menneskehår - som de mikroinjicerede sammen med frostvæske agenter i embryoet før konservering ved hjælp af de metoder, Hagedorn havde udarbejdet flere år før.
Som forskerne skriver i deres papir, ”Disse nanopartikler kan effektivt generere varme, når laserbølgelængden matcher guldnanopartiklens overfladeplasmonresonansenergi.” Det er en kompliceret måde at sige, at nanoroderne kunne absorbere og forstærke energien fra en kort lysglimt.
Guld, som mange andre stoffer, udviser forskellige egenskaber på nanoskalaen end det gør i bulk. En godt kalibreret millisekundslaserpuls kan pludselig varme et embryo op ved hjælp af det guld, der er fordelt overalt, genopvarme det med den forbløffende hastighed på 1, 4 x 10 7 ° C i minuttet, en næsten uigennemførelig temperatur, der er håndterbar i de hurtige brister, der forskerne beskæftiger.
”I den ene millisekund puls af laseren går du fra flydende nitrogen til stuetemperatur, ” siger Bischof. I modsætning til enhver metode, som Hagedorn havde forsøgt før, var resultaterne markante nok - og vidt fordelt nok - til med succes at genopvarme et helt zebrafiskembryo på én gang.
Da den barriere endelig blev krydset, forblev spørgsmål. Nøglen blandt dem var, om disse embryoner stadig ville være levedygtige. Som forskerne rapporterer i deres papir, var en betydelig del, men ikke alle. Af dem, de afrimede, gjorde 31 procent det kun en time efter opvarmning, 17 procent krydsede 3-timers-mærket, og kun 10 procent udviklede sig stadig efter 24-timers-mærket.
Selvom det måske lyder lille, er det langt større end den nul procent-overlevelsesrate, som tidligere metoder havde givet. Hagedorn håber, at det fremtidige arbejde "forbedrer" disse tal yderligere. Og hun forbliver positiv til endda tallet på 10 procent. ”En fisk kan producere millioner af æg, og hvis jeg med succes fryser 10 procent af dem, er det et rigtig godt antal, ” siger hun.
At kæmpe med millioner af æg kræver naturligvis, at de yderligere transformerer processen for effektivitet. På dette tidspunkt falder meget af dette arbejde på skuldrene til Bischof og andre i hans laboratorium, hvor arbejdet allerede er i gang for at forbedre "gennemstrømningen" af processen og potentielt omdanne den til en mere industriel indsats. ”Jeg tror, der vil være en række aktiverende teknologier, der vil blive udviklet mod det i de kommende år, ” fortalte han mig.
Hvis dette arbejde lykkes, tror Hagedorn, at det kunne have andre anvendelser, der går langt ud over den ydmyge zebrafisk.
”Masser af akvakulturbrugere ønsker at fryse fisk [reproduktionsmateriale], fordi de kun gyder en gang om året, ” sagde hun. ”Du har dette boom-og-buste-aspekt til at drive deres gårde. Hvis du kunne tage embryonerne ud af fryseren på en mere planlagt måde, ville det gøre mad billigere og mere pålidelige. ”
Det kan også have indflydelse på bevarelse af vilde dyr. Hagedorn, der i dag primært arbejder på koraller, mener, at det kan hjælpe os med at reparere beskadigede rev. Hun antyder også, at det i sidste ende kan gendanne udtømmede frøbestander og måske også redde andre arter. Uanset hvor arbejdet fører os i fremtiden, er det dog et vidnesbyrd om potentialet i videnskabeligt samarbejde i dag.
”Først følte det sig ærligt ikke rigtigt. Det giver biologisk mening, at vi kunne gøre det, men det så ud til, at vi aldrig ville samle alle brikkerne, ”fortalte hun. ”Hvis jeg ikke havde siddet ved siden af John på dette møde, ville vi aldrig have gjort det. Uden vores fælles indsats - teknik og biologi - ville dette ikke være sket. ”
